15 min如何完成一次無縫克隆實驗？

無縫克隆試劑盒原理

與傳統(tǒng)的雙酶切相比，無縫克隆過程不需要利用“內(nèi)切酶”，而是要借助“外切酶”形成dsDNA的粘性末端，并利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺口。
【注：內(nèi)切酶：水解DNA分子鏈內(nèi)部磷酸二酯鍵，生成寡/寡聚核苷酸的酶。外切酶：是在核酸鏈的末端，按序降解核苷酸的酶，產(chǎn)物是單個的核苷酸?！?/p>

Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix 作為新一代的無縫克隆試劑，專門針對多片段無縫組裝反應(yīng)進行優(yōu)化，可以一次實現(xiàn)多至5個插入片段的特定順序組裝克隆，無需特定限制性酶切位點。試劑盒中包含三種酶：T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶。

T5核酸外切酶：它能沿著5’→3’方向，降解dsDNA，形成產(chǎn)生黏性末端，便于與另外的同源末端進行配對結(jié)合。

DNA聚合酶：相同的黏性末端互補配對之后，再通過DNA聚合酶將缺失的堿基修復(fù)。

DNA連接酶：DNA片段完全堿基互補配對完成之后，DNA連接酶進一步催化其形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，實現(xiàn)無痕拼接，形成完整的DNA分子。
值得一提的是，這三種酶都可以在同一個溫度（50 ℃）下發(fā)揮良好的功能，整個反應(yīng)過程15 min即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。

圖1：Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix方法原理圖。

產(chǎn)品優(yōu)點

與傳統(tǒng)克隆相比，無縫克隆具有以下優(yōu)勢：

不受載體&酶切位點&片段序列的限制，實現(xiàn)任意組裝；

操作簡單、快速、高效， 適用于所有載體在任意位點進行定向克??；

無載體自連現(xiàn)象，克隆陽性率可達 95%以上；

一次實現(xiàn)多至5個插入片段的特定順序組裝克隆。

可組裝長達上百kb的DNA片段。

產(chǎn)品應(yīng)用

快速克隆

高通量克隆

無縫克隆

DNA定點突變。

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