新角度！新發(fā)現(xiàn)！全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組及ATAC聯(lián)合解析神經(jīng)膠質(zhì)瘤新思路

ATAC-seq即染色質(zhì)開放性檢測(cè),是基于高通量測(cè)序手段研究染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可接近性的一種技術(shù)，可以獲得全基因度尺度上處于開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，從而分析潛在的活躍轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因，目前已廣泛應(yīng)用于病理生理調(diào)控機(jī)制、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、耐藥機(jī)制探究等方向，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)合可構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組是利用ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)，無需打斷，完整測(cè)到轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)序列，相比于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組，可在準(zhǔn)確分析轉(zhuǎn)錄本水平的表達(dá)量的同時(shí)，對(duì)序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確解析，得到可變剪切、可變多聚腺苷酸、融合基因等分析結(jié)果。

四川省人民醫(yī)院龔波研究員在Journal of Genetics and Genomics雜志發(fā)表題為“ Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma ” 的研究論文，結(jié)合ATAC-seq與ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，揭示FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的致癌作用等。

中文標(biāo)題：全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組及ATAC協(xié)助解析神經(jīng)膠質(zhì)瘤致癌基因FAM20C調(diào)控

英文標(biāo)題：Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma

期刊名稱：Journal of Genetics and Genomics

合作單位：四川省人民醫(yī)院

研究對(duì)象：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁組織

測(cè)序技術(shù)：ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

百邁客為該研究提供了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組及ATAC等測(cè)序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，攻擊力極強(qiáng)，約占所有腦腫瘤的80%，目前主要的癌癥治療方案，包括手術(shù)切除、放療和化療，都會(huì)導(dǎo)致預(yù)后不良和高死亡率，很難對(duì)膠質(zhì)瘤提供理想的治療效果，因此現(xiàn)在迫切需要探索新的有效策略以及膠質(zhì)瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)。長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用在包括肝細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥類型中，ATAC-seq也已經(jīng)應(yīng)用于胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤研究中。FAM20C是一種可調(diào)節(jié)分泌途徑中的各種網(wǎng)絡(luò)的分泌蛋白，主要負(fù)責(zé)礦化激酶，然而越來越多的研究表明，FAM20C?與包括包括乳腺癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥廣泛相關(guān)。

材料方法

材料：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁（病灶旁2cm處）組織樣本

方法：ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

研究結(jié)果

用三對(duì)膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為發(fā)現(xiàn)組進(jìn)行了ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，之后又用另外6對(duì)膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為鑒定組進(jìn)行了ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，兩次測(cè)序中發(fā)現(xiàn)共有差異基因（DEG）503 個(gè)，在癌癥相關(guān)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Ras信號(hào)通路中顯著富集。另外，差異基因也在神經(jīng)元活動(dòng)通路中富集，表明神經(jīng)元激活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)，這與最近的研究一致，已經(jīng)有研究證明，突觸粘附分子神經(jīng)粘附蛋白-3（NLGN3）的活性依賴性裂解和分泌介導(dǎo)了腦癌神經(jīng)調(diào)控，有助于通過PI3K-mTOR途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖，而PIK3CA 變體已被證明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中選擇性地啟動(dòng)大腦過度活躍，并在神經(jīng)元環(huán)境的腫瘤重塑中增加活性發(fā)揮重要作用。因此，鑒定出的神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)DEGs為神經(jīng)元和膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間串?dāng)_的前瞻性研究奠定了基礎(chǔ)。

APA分析結(jié)果顯示，在發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集以及鑒定數(shù)據(jù)集中，共鑒定到了12492個(gè)APA事件，兩組各自有97例和260例APA事件顯示出顯著差異，且各有52例和65例APA在兩組中顯示存在多A位點(diǎn)，為了分析APA事件與差異表達(dá)基因的關(guān)系，結(jié)果中比較了差異APA及差異基因集合，發(fā)現(xiàn)大部分共有基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中APA 信號(hào)和表達(dá)都呈現(xiàn)較低水平，這意味著更多的多聚腺苷酸化可能有助于 mRNA 的穩(wěn)定性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的APA事件與基因表達(dá)高度相關(guān)，表明APA事件在這些基因的失調(diào)和膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。

為了探究神經(jīng)膠質(zhì)瘤中基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的6個(gè)樣本進(jìn)行了ATAC測(cè)序，鑒定出與1129個(gè)基因關(guān)聯(lián)的1176個(gè)差異峰（DPs），如預(yù)期所料，大多數(shù)DPs分布在基因結(jié)構(gòu)的近端啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果中觀察到兩個(gè)增加的Glypican 1（GPC1）DPs信號(hào)，其中一個(gè)位于啟動(dòng)子中，另一個(gè)位于第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中還觀察到蛋白酪氨酸磷酸酶受體 B 型 （PTPRB） 的 DP 信號(hào)降低（內(nèi)含子區(qū)），隨后將1129個(gè)DPs相關(guān)基因和503個(gè)常見DEGs進(jìn)行比較，找到交集的22個(gè)基因，結(jié)合CGGA數(shù)據(jù)庫分析對(duì)應(yīng)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有16個(gè)基因顯著差異表達(dá)，針對(duì)這16個(gè)基因的患者生存率分析發(fā)現(xiàn)，僅?RAB3A?和?FAM20C?同時(shí)具有預(yù)后及臨床的意義，另外這22個(gè)基因中，NPTN基因也是目前研究熱度較高的基因。通過qRT-PCR和免疫組化（IHC）染色驗(yàn)證了NPTN和FAM20C在我們收集的神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)，在膠質(zhì)瘤較高階段的樣品中觀察到NPTN的表達(dá)顯著降低，相反，FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)顯著增加，特別是在IV期，IHC 染色進(jìn)一步驗(yàn)證了?NPTN?通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展到晚期來抵消?FAM20C?的致癌功能。

最后，為了探索與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中?FAM20C?和?NPTN?失調(diào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從在線數(shù)據(jù)庫 ChIP-Atlas 下載組蛋白標(biāo)記物（H3K4me 和 H3K27ac）的 ChIP 數(shù)據(jù)，并用TCGA數(shù)據(jù)集驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)錄因子在FAM20C或NPTN中的表達(dá)，最終結(jié)果表明，在TCGA數(shù)據(jù)集中，REST與FAM20C的相關(guān)系數(shù)最高。鑒定出兩個(gè)反式活性因子（BRD4 和 REST）與?FAM20C?和?NPTN?均呈正相關(guān)。結(jié)合染色質(zhì)可及性、TFs 結(jié)合位點(diǎn)和 APA 分析共同影響基因表達(dá)，結(jié)果表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中NPTN的表達(dá)顯著降低，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中觀察到的峰值信號(hào)增加。此外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN的APA數(shù)量明顯小于對(duì)照組。因此，提出了APA編號(hào)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占主導(dǎo)地位的假設(shè)，本研究開創(chuàng)了FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床意義、體外功能和樞紐轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，F(xiàn)AM20C 抗體顯著消除了?FAM20C?異位表達(dá)引起的腫瘤大小增加，總之，本項(xiàng)研究證明了轉(zhuǎn)錄激活的?FAM20C?是一種致癌基因，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有治療意義。

 

參考文獻(xiàn)：

Gong B, Liang Y, Zhang Q, Li H, Xiao J, Wang L, Chen H, Yang W, Wang X, Wang Y, He Z. Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma.?J Genet Genomics. 2023 Jun;50(6):422-433. doi:10.1016/j.jgg.2023.01.008. Epub 2023 Jan 25.