2021年5月，百邁客和暨南大學第一附屬醫(yī)院合作的文章“The SNAG Domain of Insm1 Regulates Pancreatic Endocrine Cell Differentiation and Represses β- to δ-Cell Transdifferentiation”見刊啦！發(fā)表在《Diabetes》（IF=9.464）。今天小編帶大家一起解讀一下該文章，看看具體做了些什么研究！
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英文題目：The SNAG Domain of Insm1 Regulates Pancreatic Endocrine Cell Differentiation and Represses β- to δ-Cell Transdifferentiation
中文題目：Insm1 的 SNAG 域調節(jié)胰腺內分泌細胞分化并抑制β細胞轉分化為δ細胞
發(fā)表雜志：Diabetes
影響因子：9.464
發(fā)表時間：2021年5月
合作單位：暨南大學第一附屬醫(yī)院
胰腺內分泌系統(tǒng)受轉錄因子的嚴格調控，系統(tǒng)失調引起各種代謝疾病的發(fā)生，包括糖尿病。胰島素瘤相關蛋白 1 ( Insm1)編碼一種包含有一個 SNAG 結構域和五個鋅指結構的蛋白質，并在胰腺內分泌細胞分化和成熟 β 細胞功能中起重要作用。
在本研究中，比較了 Insm1 null 和 Insm1 SNAG 域突變體 (Insm1delSNAG) 之間胰腺內分泌細胞的分化，以研究Insm1 SNAG 域的特定功能。結果表明與對照小鼠相比，Insm1delSNAG 中δ細胞數(shù)量增加，而Insm1 null突變體中卻沒有增加；同時Insm1delSNAG 中β細胞數(shù)量的減少不像在Insm1 null突變體中那樣嚴重。此外，在 Insm1delSNAG 和 Insm1 null突變體的α-、PP（胰多肽）和ε細胞中觀察到類似的細胞數(shù)減少現(xiàn)象。本研究進一步明確δ細胞數(shù)量的增加是因為β細胞轉分化為δ細胞。從機制上來說，Insm1 的 SNAG 結構域與 Lsd1（H3K4me1/2 的去甲基化酶）相互作用。Insm1 的 SNAG域中的突變導致 Lsd1 的募集受損，并增加了與 Insm1 結合的造血表達同源盒（Hhex）位點中H3K4me1/2的水平，從而提升δ細胞特異性基因Hhex的轉錄活性。本研究已經確定了Insm1的SNAG域在調節(jié)胰腺內分泌細胞分化中的新功能，特別是在抑制β細胞轉分化為δ細胞。
實驗設計
材料：Insm1delSNAG突變小鼠（Insm1delSNAG/lacZ)），Insm1非突變小鼠(Insm1lacZ/lacZ)；雜合對照小鼠（Insm1+/lacZ)。β細胞敲除小鼠(InsCre;Insm1f/delSNAG; CKO)，Cre雜合對照小鼠(InsCre;Insm1f/+)；Cre對照小鼠(InsCre;Insm1+/+)
RNA-seq樣本：取E18.5時胰腺，每種基因型4個重復：Insm1+/lacZ (control),Insm1lacZ/lacZ (Insm1 null), 和Insm1delSNAG/lacZ (Insm1del-SNAG)。
實驗技術： 免疫熒光分析，RNA-seq（轉錄組測序由百邁客協(xié)助完成），免疫沉淀、WB和ChIP-PCR驗證。
測序平臺： Illumina NovaSeq 6000
文章結果
1、Insm1 SNAG域改變了突變小鼠胰腺內分泌系統(tǒng)的分化
本研究的目的是確定Insm1的SNAG域在胰腺內分泌細胞的發(fā)育中的特異功能。特別是分析了Insm1delSNAG/lacZ(Insm1delSNA突變體)，Insm1lacZ/lacZ (Insm1 null突變體)和Insm1+/lacZ(對照) 同窩出生小鼠胚胎的免疫熒光。
通過β-gal（lacZ等位基因的表達）染色，觀察到Insm1delSNAG突變體的胰腺在E18.5時胰島素陽性β細胞數(shù)量減少，但是沒有像Insm1 null突變小鼠中那么嚴重（圖1A–A”’）。與對照相比，在Insm1delSNAG或Insm1中沒有觀察到α細胞數(shù)有變化（圖1B）。同時發(fā)現(xiàn)和對照相比，在Insm1delSNAG和Insm1-null突變體中觀察到PP數(shù)量的增加和δ細胞的減少（圖1D和E）。然而與對照小鼠相比，Insm1delSNAG突變體中生長抑素陽性的δ細胞數(shù)量顯著增加，且在Insm1-null突變體中細胞數(shù)減少了（圖1C–C”）。
圖1.Insm1delSANG突變小鼠在E18.5時胰腺內分泌細胞分化受損
為了確認這些減少現(xiàn)象是否發(fā)生在早期發(fā)育階段（即E15.5），檢測了胰腺E15.5的內分泌系統(tǒng)。結果與對照相比，Insm1delSNAG和Insm1-null突變體中在觀察到一個類似的減少現(xiàn)象，包括胰島素，胰高血糖素，PP-和饑餓素陽性細胞（圖2）。然而，生長抑素陽性細胞的數(shù)量在Insm1delSNAG或Insm1-null突變體中都沒有發(fā)生改變（圖2C–C”）。因此，Insm1delSNAG突變體中δ細胞數(shù)量的增加發(fā)生在E18.5，而不在E15.5。
圖2.Insm1delSANG突變小鼠在E15.5時胰腺內分泌細胞分化受損
接下來研究了Insm1delSNAG突變體中的胰島特異性轉錄因子的表達。將野生型和雜合子作為對照，檢測與Insm1結合的轉錄因子SMAFA、MafB、Pdx1、Pax6、Ngn3和Isl1/2（圖3和4）。在E18.5（圖3A–C）和E15.5（圖4A–C）時，與野生型或者雜合對照相比，Insm1delSNAG突變體的胰島中MafA和MafB表達顯著降低，Pdx1表達輕度下降。Pax6的表達在E18.5時降低，但是在E15.5時只有輕微變化（圖3D和圖4D）。Isl1/2和內分泌細胞前體細胞標記物Ngn3在兩個階段均無變化（圖3E、F和4E、F）。因此，Insm1delSNAG突變導致α-和β-特異性轉錄因子表達降低，而不是前體細胞或泛胰島因子。
圖3. E18.5時胰島特異性轉錄因子的表達
圖4. E15.5時胰島特異性轉錄因子的表達
2、Insm1delSNAG突變體的胰腺中的基因表達
選用E18.5時Insm1delSNAG，Insm1 null和對照組小鼠的胰腺，利用RNA-seq研究Insm1delSNAG突變體胰臟內的特異性基因表達。分析發(fā)現(xiàn)在Insm1delSNAG突變體胰腺中，共有231個基因顯著失調，這些基因涉及發(fā)育和激素分泌方面。同時發(fā)現(xiàn)Insm1delSNAG和null 突變有顯著的差異基因交集，尤其是編碼激素的基因和與葡萄糖代謝和分泌調節(jié)相關的基因(圖5A、B)。Insm1delSNAG突變體中大約72.7%的差異基因也在Insm1 null突變體中被檢測到。然而與Insm1delSNAG突變體相比,Insm1 null突變體中有著更多的基因表達和數(shù)量上的變化。這些結果與在Insm1delSNAG突變體中發(fā)現(xiàn)比Insm1null突變體中β細胞更少這一現(xiàn)象一致。
對比對照組或Insm1 null突變小鼠，在Insm1delSNAG突變小鼠中δ細胞特異性基因生長抑素(Sst)、Hhex和視黃醇結合蛋白4 (Rbp4)基因在胰腺中上調(圖5C)。這與免疫染色觀察到δ細胞數(shù)量的增加這一發(fā)現(xiàn)一致。大多數(shù)失調基因已通過實時RT-PCR被驗證(圖5D)。
圖5.InsmdelSNAG突變小鼠胰腺的基因表達
3、β細胞向δ細胞的轉分化
前面數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Insm1delSNAG突變體在E15.5之后δ細胞數(shù)量增加（圖1C和2C），為了驗證細胞數(shù)的增加是否是δ細胞增殖促成的，該研究在E15.5和E18.5時的Insm1delSNAG突變小鼠中進行了Ki67和生長抑素的共染色。在δ細胞中觀察到類似的增殖率，增殖率通過對照和Insm1 null或Insm1delSNAG突變體中Ki67+Sst+/Sst+的比值來表示。同時也檢測了Insm1delSNAG突變體中δ細胞低凋亡率的可能性，是否是導致細胞數(shù)量差異的原因。然而Insm1delSNAG、Insm1 null突變體和對照小鼠中生長抑素陽性細胞率極低，并無差異。
生長抑素和胰島素或胰高血糖素的復合染色很少被觀察到，且在Insm1delSNAG突變體和對照小鼠之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。但是在E15.5和E18.5時Insm1delSNAG突變體中，檢測到Sst和β細胞特異性轉錄因子Nkx6.1的復合染色信號增強(圖6A、B)。Sst與Nkx6.1的共表達表明Insm1delSNAG中δ細胞有可能會從β細胞轉化而來。
因此，使用了InsCre;Insm1delSNAG/flox (CKO)小鼠研究動物模型中δ細胞的數(shù)量是否增加，并帶有β細胞特異性SNAG突變。在新生CKO小鼠的胰腺中觀察到δ細胞數(shù)量顯著增加(圖7A)。說明具有β細胞特異性的Insm1delSNAG突變導致δ細胞數(shù)增加。進一步使用具有β細胞特異性小鼠模型mTmG;InsCre;Insm1delSNAG/flox (tracing-CKO）驗證β細胞向δ細胞的轉分化。利用GFP追蹤Insm1delSNAG突變的β細胞，在具有β細胞特異性的insm1delsnag突變體胰腺中發(fā)現(xiàn)與Sst共染色的GFP信號增強，但在對照組mTmG；InsCre；Insm1+/flox小鼠中顯著減輕(圖7 B)。結果說明β細胞向δ細胞轉分化發(fā)生于Insm1delSNAG突變的胰腺β細胞。
圖6.β細胞中Nkx6.1+Sst+細胞數(shù)增多
圖7.Insm1delSNAG突變小鼠中β細胞向δ細胞轉分化
4、Insm1delSNAG突變改變了Insm1和Lsd1之間的交互作用
為了進一步闡明Insm1的SNAG結構域的分子功能，本研究通過免疫共沉淀法檢測與Insm1delSNAG相互作用的蛋白。本文檢測到Lsd1無法在轉染Insm1del-SNAG-Flag的SJb b細胞中被Flag抗體拉下來(圖8A)。這一結果與先前對垂體細胞的觀察結果一致。Insm1可以在胰腺β細胞中與NeuroD1和FoxA2互相作用。因此使用NeuroD1和FoxA2抗體在含有Insm1delSNAG-Flag或Insm1-Flag蛋白同一細胞裂解液中進行免疫共沉淀，觀察到Insm1的SNAG域突變并沒有阻止Insm1與NeuroD1或FoxA2之間的相互作用(圖8A)。因此，Insm1delSNAG突變破壞了Insm1與Lsd1之間的相互作用，但不破壞Insm1與NeuroD1或FoxA2之間的相互作用。
在胰腺β細胞系中進行的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析顯示，Insm1可以結合在基因內含子和下游18kb的Hhex位點(圖8B)，在這些結合位點周圍有一個H3K4me1富集區(qū)(圖8B，上圖)。這些特征在胰外分泌細胞特異性基因Amy1的位點上并沒有觀察到(圖8B，下圖)。利用Insm1和Lsd1的抗體通過ChIP-PCR驗證Insm1招募的Lsd1的特異性DNA結合位點，結果觀察到與Amy1位點相比，Lsd1在Insm1結合位點，Hhex1的內含子和下游18kb區(qū)域富集，同時Insm1突變體SJb細胞中Lsd1的這兩個結合位點富集減少(圖8C和D)。Lsd1特別表現(xiàn)出組蛋白修飾H3K4me2和H3K4me1的去甲基化酶活性。
利用H3K4me1和H3K4me2的抗體在對照和Insm1delSNAG突變體的胰島中進行ChIP-PCR，研究Insm1SNAG-Lsd1是否調控H3K4me1和H3K4me2兩種組蛋白修飾。結果檢測到相比野生型胰島，在Insm1delSNAG突變體的胰島中，H3K4me2在Hhex基因的內含子和18 kb下游位點，以及H3K4me1在Hhex的18 kb下游位點有著顯著富集(圖8E和F)。SNAG突變擾亂了Insm1募集Lsd1的結合位點，導致H3K4me1/H3K4me2水平增加，特別是δ細胞特異性基因Hhex。
圖8. Insm1的SNAG結構域招募Lsd1
總結
在目前的研究中發(fā)現(xiàn)與Insm1null突變相比，Insm1的SNAG結構域在α、PP和ε細胞中導致發(fā)育缺陷，但在β細胞中沒有那么嚴重。Insm1的SNAG突變破壞Insm1和Lsd1之間的相互作用。然而，Insm1-NeuroD1或Insm1-FoxA2的互相作用得以保留。NeuroD1和FoxA2在胰腺β細胞發(fā)育中起重要作用;Insm1delSNAG與這些因子之間相互作用的維持部分解釋了Insm1delSNAG突變小鼠β細胞發(fā)育缺陷相對于Insm1null突變小鼠不那么嚴重的原因。研究證明了Insm1的SNAG域的突變導致β轉分化為δ細胞。同時發(fā)現(xiàn)Insm1的SNAG結構域與Lsd1相互作用并將其吸附到DNA上。突變的SNAG結構域阻斷Lsd1的募集，導致δ細胞特異性基因Hhex位點的H3K4me1和H3K4me2水平升高。
本文結論:在胰腺β細胞發(fā)育過程中，Insm1部分通過招募β細胞來抑制δ細胞命運Lsd1通過它的SNAG域。然而，考慮到Lsd1可以以時間和細胞依賴性的方式進一步招募各種組蛋白修飾復合物，我們所確定的分子機制可能只揭示了部分調控場景。綜上所述，研究證明了Insm1對于所有胰腺內分泌細胞的分化至關重要，特別是對抑制β轉分化為δ細胞。
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